Metody badania genów

Ludzki organizm to niesamowicie skomplikowana, a zarazem bardzo dobrze zorganizowana maszyna. Podstawową jednostką organizacji naszego organizmu jest kod genetyczny DNA. To właśnie kod genetyczny stanowi instrukcje działania dla wszystkich innych struktur organizmu.

Ludzkie DNA umiejscowione jest w jądrze komórkowym każdej komórki naszego ciała. Nie jest jednak tak, że raz uformowany zestaw komórek jest z nami do końca naszego życia. Długość życia komórki zależy od jej typu, ale zazwyczaj nie przekracza on okresu kilku miesięcy. Każda komórka zanim skończy swój żywot dokonuje podziału, a więc z każdej starej zmęczonej komórki powstają dwie nowe. Razem z podziałem komórki dzielony, a później powielany jest materiał genetyczny znajdujący się w tych komórkach. Niestety nie każdy podział komórki udaje się w 100%. Czasami polimeraza, czyli enzym, który zajmuje się odbudową łańcucha DNA popełnia błąd. W organizmie człowieka znajduje się wiele białek, które kontrolują jakość nowopowstałych komórek i jeśli wykryją błąd kierują komórkę do apoptozy, czyli procesu programowanej śmierci komórki. Białka opiekunki niestety również nie są nieomylne i czasami nie uda im się wykryć wszystkich błędów. Tak tworzą się mutacje genetyczne. Nie wszystkie zmiany w sekwencji kodu genetycznego są złe i patogenne. Większość mutacji to polimorfizmy, które tworzą naszą zmienność genetyczną. To dzięki polimorfizmom nie wszyscy wyglądamy tak samo, w ten sposób reagujemy na leki, mamy różne predyspozycje i talenty.

Proces nowotworzenia zazwyczaj rozpoczyna się od miejscowej, czyli somatycznej mutacji genetycznej, w konsekwencji której dochodzi do upośledzenia działania komórek i ich niepohamowanego namnażania się. Mutacje genetyczne mogą pojawić się również
w komórkach germinalnych (komórki rozrodcze). Takie mutacje genetyczne zostają już z nami do końca naszego życia, a co więcej jesteśmy w stanie przekazać je swoim dzieciom.

Badania nad sekwencją i funkcją kodu genetycznego przyczyniły się do zrozumienia mechanizmów powstawania wielu chorób genetycznych, w tym także nowotworów. Dzięki badaniom genetycznym powstało wiele nowoczesnych terapii celowanych, które znacząco zmieniły podejście do terapii nowotworowych.

W zależności od typu mutacji genetycznych stosuje się różne rodzaje badań genetycznych. Poniżej opisujemy jedne z najważniejszych metod stosowanych w genetycznej diagnostyce onkologicznej.

Sekwencjonowanie nowej generacji (ang. next generation sequencing – NGS) jest techniką służącą do odczytu całych sekwencji DNA lub RNA. Procedura NGS rozpoczyna się od przygotowania tzw. bibliotek. Pierwszym etapem jest pofragmentowanie materiału DNA na odcinki o długości około 200-300 par zasad, a następnie przyłączenie do nich indeksów (pozwalających na identyfikacje pacjentów) i adapterów. W przypadku sekwencjonowania całych eksonów, czy wybranych paneli genów, analizowane regiony są powielane poprzez reakcje PCR, a następnie hybrydyzowane z sondami odpowiadającymi badanym regionom. Tak przygotowane DNA trafia do sekwenatora. Zdecydowanie najczęściej używanymi technologiami sekwencjonowania są te opracowane przez firmę Illumina. W technologii tej wcześniej przygotowane DNA nanoszone jest na płytkę reakcyjną i przyłączane są do nich losowo oligonuklotydy unieruchomione na jej powierzchni. Następnie fragmenty DNA są namnażane, tworząc klastry, czyli zgrupowania fragmentów o jednakowej sekwencji. Do klastrów przyłączane są nukleotydy znakowane fluorescencyjnie, a następnie każdy z klastrów jest skanowany
i zapisywany tworząc tzw. odczyty (fragmenty od 75 do 300nt). Cały cykl powtarzany jest wielokrotnie tak, by wytworzyć odpowiednią głębokość sekwencjonowania, która sprawia, że odczytana sekwencja jest wiarygodna. Po zakończonym procesie sekwencjonowania przeprowadzana jest analiza bioinformatyczna, która konwertuje ogrom danych NGS
w indywidualny wynik pacjenta.

Ze względu na to, że w badaniu NGS na raz odczytywane są krótkie fragmenty DNA/RNA, metoda ta najlepsza jest do odczytywania pojedynczych zmian nukleotydowych (SNP), krótkich insercji
i delecji (do długości ok. 50nt) oraz mozaik DNA, czyli wariantów, które występują w mniej niż połowie alleli. NGS jest świetną metodą, jeśli chcemy wykonać badanie przesiewowe obejmujące całą sekwencje kodującą genu, wielu genów, a nawet badanie całego egzomu.

Naukowcy z roku na rok rozwijają potencjał diagnostyczny metody NGS. Dziś możemy dzięki tej metodzie wykrywać nie tylko pojedyncze lub krótkie mutacje genetyczne, ale także określić stan predyspozycji do tworzenia się mutacji lub stopień deficytu rekombinacji homologicznej oraz wykryć fuzje genowe.

Sekwencjonowanie Sangera jest podstawową techniką molekularną stosowaną w identyfikacji substytucji oraz małych delecji i duplikacji. Aby przeprowadzić sekwencjonowanie metodą Sangera należy zaprojektować tzw. startery, czyli krótkie fragmenty DNA okalające badaną mutacje, które wyznaczają nam początek i koniec sekwencjonwania. Fragmenty te „wycinane” są z całej sekwencji genomowego DNA pacjentów, a następnie powielane przy użyciu metody PCR. Aby poznać sekwencje DNA, przeprowadza się enzymatyczną syntezę nowej nici DNA na tzw. matrycy w obecności deoksynukleotydów (dNTP). Dodanie do reakcji dNTP oraz polimerazy DNA powoduje wydłużanie się syntetyzowanej nici DNA. Każdy dNTP jest znakowany fluorescencyjnie. Aby poznać sekwencje, należy jeszcze tylko przeprowadzić rozdział produktów sekwencjonowania, aby uszeregować fragmenty według wielkości i określić kolor włączonego dNTP. Wynik sekwencjonowania Sangera obrazowany jest na chromatogramie, który wyrysowuje piki o różnych kolorach odpowiadających jednej z czterech zasad azotowych.

Metoda ta jest znacznie tańsza od sekwencjonowania wielkoskalowego NGS. Zalecana jest jako metoda walidacji wyników NGS oraz do wykrywania konkretnych mutacji np. u krewnych pacjentów. Używając tej metody nie poznamy całej sekwencji kodującej genu. Maksymalny zakres sekwencjonowania Sangera to ok. 1000nt.

MLPA to technika oparta na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), która analizuje jednocześnie kilka punktów DNA pod kątem zmian w liczbie kopii, zwykle obejmujących jeden lub kilka eksonów. MLPA rozpoczyna się od denaturacji dwuniciowego DNA do pojedynczych nici
i hybrydyzacji z sondami MLPA zlokalizowanymi w różnych odstępach w eksonach danego genu. Każda sonda składa się z dwóch oddzielnych oligonukleotydów (jednego na końcu 5′ i jednego na końcu 3′) badanego fragmentu DNA. Reakcja ligacji następuje, gdy sąsiednie sondy są w stanie hybrydyzować się ze swoimi sekwencjami docelowymi. Jeśli natomiast do ligacji nie dojdzie, oznaczać to może utratę pewnego regionu genu. Oprócz oligonukleotydów specyficznych dla genu, każda sonda zawiera również uniwersalną sekwencję starterów, która umożliwia jednoczesne zajście reakcji PCR. Wszystkie zligowane sondy są amplifikowane, a następnie każdy produkt PCR oddziela się za pomocą elektroforezy kapilarnej. Produkty tej reakcji są następnie analizowane poprzez pomiar fluorescencji wytwarzanej przez ilość produktu PCR powstałego po amplifikacji i porównywane z DNA kontrolnym.

MLPA jest metodą do wykrywania dużych delecji i insercji. Jest natomiast w stanie zidentyfikować jedynie różnice w liczbie kopii, czyli tak naprawdę stwierdzić, czy mutacja jest czy jej nie ma. Co więcej, identyfikacja delecji lub duplikacji nie zdefiniuje dokładnych punktów pojawienia się mutacji. Dodatkowo, MLPA ma ograniczoną zdolność do identyfikowania delecji/duplikacji mozaiki, jeśli wariant występuje w mniej niż 30% analizowanych komórek.